產(chǎn)品說(shuō)明

• 二氧甲基轉(zhuǎn)移酶是一種牛痘病毒來(lái)源的甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠以S－腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，在RNA 5'末端緊鄰帽結(jié)構(gòu)的第一個(gè)核苷酸的2'-O上添加一個(gè)甲基基團(tuán)，把Cap 0甲基化為Cap 1結(jié)構(gòu)。Cap1結(jié)構(gòu)能增強(qiáng)mRNA的翻譯效率，因此可有助于改善mRNA轉(zhuǎn)染和顯微注射實(shí)驗(yàn)中mRNA的表達(dá)。 另外，此酶只能作用于帶有7－甲基鳥(niǎo)苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的RNA，并不會(huì)作用于5'末端為pN、ppN、pppN或GpppN結(jié)構(gòu)的RNA。
• 來(lái)源：二氧甲基轉(zhuǎn)移酶純化自攜帶二氧甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體的BL21大腸桿菌。

產(chǎn)品用途

以Cap0 mRNA為前體，制備具有Cap1結(jié)構(gòu)的mRNA

產(chǎn)品包裝

活性定義

在37℃、pH8.0的條件下， 1小時(shí)內(nèi)使10 nmol的20個(gè)核苷酸20nt）帶有7－甲基鳥(niǎo)苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的mRNA甲基化所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位。

保存體系

• 50%甘油，20 mM Tris-HCl（25℃，pH 8.0）, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA，0.1% Triton X-100。
• 保存溫度：-20±5℃，或-80℃長(zhǎng)期保存。

從Cap0 mRNA制備Cap1 mRNA，參考反應(yīng)體系（20μl）

一步法生成Cap1 mRNA，參考反應(yīng)體系（20μl）

37℃孵育1小時(shí)。(若RNA小于200nt，可以延長(zhǎng)至3小時(shí))

注意事項(xiàng)

1. 所用于實(shí)驗(yàn)的mRNA必須經(jīng)過(guò)純化并用無(wú)核酸酶水溶解，溶液中不能含EDTA和鹽。
2. 建議在反應(yīng)前熱處理mRNA，以去除5'末端的二級(jí)結(jié)構(gòu)，若5'端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可將熱處理時(shí)間延長(zhǎng)至10 min。
3. 若已知mRNA 5'末端的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至3小時(shí)以提高加帽效率。5'末端二級(jí)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的mRNA，可以不經(jīng)過(guò)熱處理直接進(jìn)行加帽反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)體系需要優(yōu)化以獲得最佳的加帽效率。
4. SAM穩(wěn)定性較差，需要在反應(yīng)開(kāi)始之前現(xiàn)配現(xiàn)用?；趯?shí)驗(yàn)所需用量，在反應(yīng)開(kāi)始前將32mMSAM儲(chǔ)備液稀釋成2mM的工作液冰上保存?zhèn)溆谩?/span>
5. 建議在反應(yīng)體系中添加RNase抑制劑(終濃度為1U/μl)，防止RNase導(dǎo)致的mRNA降解。